摘要：针对羟基磷灰石材料强度低、韧度低的问题，本文提出了一种基于LB膜技术的胶原覆层生物材料制备方法。将胶原蛋白用碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解成分子量200~5 000 Da的胶原蛋白肽，利用LB膜技术制备胶原蛋白肽单分子层，将其覆层至羟基磷灰石片上。采用原子力显微镜（AFM）对覆层的胶原蛋白肽膜进行表征，并对覆层材料进行了理化性能分析，最后通过MC3T3-E1细胞在覆层材料上的培养情况研究其生物性能。结果表明：AFM发现膜的表面平整，单层厚度约为3.1 nm，其覆层材料性质稳定，有良好的力学性能，杨氏模量最高可达6.21±0.18 MPa，MC3T3-E1细胞在覆层材料上生长良好。因此，可以利用LB膜技术制备新型胶原覆层材料，为研发新型医用生物覆层材料提供新思路。

近年来，交通事故、自然灾害、疾病等多种原因造成的人体组织和器官损伤日益增多，人体组织和器官修复的需求正日益突出。因此，生物材料作为一种新型医疗功能材料越来越受到研究者的关注。在对人体组织或血液无不良影响的前提下，生物材料可以用于治疗、修复或暂时替代损伤的人体组织和器官。生物材料有天然来源和人工合成两大类，其中天然来源的材料又分为天然高分子和天然无机物2种[1]。

羟基磷灰石(hydroxyapatite，HA)具有与人骨骼中的无机盐极为相似的晶体结构[2,3]，主要用于人骨修复[4,5]，如牙槽脊增高、口腔种植、骨替换等方面。该材料本身安全、无毒，耐腐蚀强度高，具有良好生物相容性，在临床上被广泛应用。羟基磷灰石具有传导骨生长的特性[6]，即新骨可以从HA与原骨结合处沿着表面或贯通孔隙继续生长，这种特性是其与骨组织的成分结构相似性的表现。因此，临床上的HA材料与人骨中磷灰石晶体越相似，医疗效果越好。然而，材料本身较低的强度和韧性限制了其应用范围，目前主要应用于牙科和整形外科等临床上的低负荷承载力材料[7]。对HA材料进行覆层[8-10]增强其强度和韧性是该材料的重要发展方向。

胶原是一种常用的覆层材料，具有良好的生物相容性和组织结合力[11-13]，可以促进细胞生长，引导组织分化。Langmuir-Blodgett(LB)膜技术是一种新型覆层技术[14-16]，在气液界面上将两亲性分子有序排列，形成单分子薄膜，再将其转移到固体表面，可根据需要通过多次转移得到多层覆层材料，制备的材料覆层均匀可控。通过LB膜技术将胶原覆层到羟基磷灰石材料上，可以改善材料的性能，研制新型覆层材料。

本研究拟制备分子量均一的胶原蛋白肽，通过LB膜技术制备单分子层，并将其覆层在羟基磷灰石表面，对制备的覆层材料进行AFM表征，研究覆层稳定性，分析其力学性能变化，考察生物培养性能，为研发新型医用生物覆层材料提供理论基础。

1材料与方法

1.1材料与仪器

胶原蛋白、胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶和碱性蛋白酶购自美国SIGMA公司，羟基磷灰石片由中国科学院过程工程研究所提供，其他试剂均为市售分析纯。

草莓视频黄网，原子力显微镜(AFM)，高效液相色谱仪(Agilent 1100)，万能材料试验机300DX。

1.2实验方法

1.2.1胶原蛋白肽制备

将1 g胶原蛋白加入到50 ml水中，加热搅拌使其全部溶解，然后加入碱性蛋白酶50 mg，胰蛋白酶20 mg，保持温度为37℃，pH值为8.0，搅拌反应1 h后，将pH值调为7.0，煮沸灭酶10 min，离心取上清，冷冻干燥，得到胶原蛋白肽备用。

1.2.2胶原蛋白肽分子量分析

使用凝胶过滤色谱法(HPSEC)分析，色谱柱：TSK3000SW(300 mm×7.5 mm I.D.,10μm)；流动相：磷酸缓冲液(0.02 mol/L，pH 7.0)；流速：0.4 mL/min；检测波长：280 nm；进样量：10 mL。

1.2.3 LB膜制备

将胶原蛋白肽溶于氯仿，配置成0.5 mg/mL溶液。在草莓视频黄网中加入超纯水作为亚相，滴加500μL胶原蛋白肽溶液，挥发30 min，压膜速率为5 mm/min。

1.2.4羟基磷灰石覆层

维持表面压23 mN/m，将羟基磷灰石片浸入亚相中，采用垂直提拉法，使胶原蛋白肽覆层在羟基磷灰石表面，提拉速度为7.5 mm/min，根据实验需求控制覆层次数。

1.2.5原子力显微镜

用原子力显微镜对羟基磷灰石片上的覆层胶原蛋白肽进行观察，采用间接接触模式，扫描范围由大到小，通过NanoScope Analysis软件处理图像。

1.2.6稳定性分析

为检测覆层材料的稳定性，将材料浸泡在50倍体积的生理盐水中24 h，收集浸泡液备用。继续用10倍体积生理盐水反冲洗材料，冲洗10次后收集冲洗液，更换生理盐水冲洗20次、30次、50次，收集冲洗液。将浸泡液、各次冲洗液浓缩，检测其中蛋白含量。

1.2.7杨氏模量测定

将胶原覆层羟基磷灰石材料置于万能材料试验机上，以2 mm/min的速度测试材料的压缩应力，根据力与位移的关系绘制应力-应变曲线，计算材料杨氏模量，每个样品测试5次，取平均值。

1.2.8生物性能测试

用MC3T3-E1细胞对覆层材料的细胞增殖活性进行评价，通过CCK-8法，分为覆层材料组和空白材料对照组，细胞培养周期为5天，每天取样5个复孔，每孔分别加入50μL CCK-8试剂，37℃恒温培养箱中(5%CO2)孵育4 h，每孔吸取100μL样品，检测其450 nm处的吸光度，每组取平均值，绘制细胞增殖曲线。